儀器： BI-200SMBI-MwA
使用 BI-200SM 測量蛋白質樣品的分子量
摘要
靜態光散射（SLS）能夠測量多分散材料以及具有離散聚集數樣品（如蛋白質）的平均分子量。合成聚合物本質上是多分散的，非常適合使用這種技術進行直接分析，用平均分子量來更為直觀地表示。以牛血清白蛋白（BSA）為例，這種蛋白質有三種異構體（分子量分別為 66.5kDa 、133 kDa 和 200 kDa），此時平均分子量的含義可能就沒那么清晰。通過將使用傳統靜態光散射法在廣角光散射系統上測量的分子量與通過尺寸排阻色譜（SEC）實驗得到的相對豐度進行比較，可以說明這種關系的性質。
引言
牛血清白蛋白（BSA）是一種易于獲取的蛋白質，常被用作更復雜蛋白質或蛋白質藥物的替代品。眾所周知，在生理 pH 值和離子強度附近，BSA 處于三種具有明確聚集數的異構體（單體、二聚體、三聚體，N agg 分別為 1, 2, 3）的平衡狀態。雖然動態光散射（DLS）技術很難解決這些問題，但還是存在一定的可能性。而靜態光散射（SLS）由于不具備分辨能力，只能得到一個單一的平均分子量。
結果
這種表達方式（圖 1）被稱為 Zimm 圖 ，它需要進行濃度和角度依賴的光強測量。 Zimm 圖 是一種多角度、多濃度的外推法，分別外推至零角度和零濃度。測量的濃度分別為 10 mg/mL、3 mg/mL 和 2 mg/mL，散射角度為 θ = 60°、75°、90°、105° 和 120o。測得的平均分子量約為 81 kDa，這個值對于 BSA 單體（66.5 kDa ）而言太大，但又明顯低于二聚體（133 kDa）或三聚體（200 kDa）。為了理解這一點，必須考慮到 BSA 單體與多聚體始終處于平衡狀態。
單體 ? 二聚體 ? 三聚體
對于已知材料（在本例中為蛋白質），其折光指數與濃度之間的關系是已知的。如果該物質的折光指數增量（dn/dc）已知，就可以確定其絕對濃度。
dn/dc 是折射率（ns）對濃度作圖并外推至零濃度時的斜率。其中，ns 是溶液的折射率。該斜率在很寬的濃度范圍內通常呈線性，因此極限斜率往往與稀溶液條件下的斜率相同。
這類似于在已知摩爾消光系數的條件下，通過在 280 nm 處的紫外吸光度測量來確定濃度。在下面所示的色譜實驗（圖2）中，初始濃度是已知的，因此即使沒有任何外部校準，也可以確定每種物質的相對豐度。
微分折光指數（圖2）與濃度成正比，因此可以從數量上對各組分（單體和二聚體）的相對含量進行量化。雖然認為存在三聚體，但由于其含量過低，僅通過折光指數無法識別。在知道 BSA 單體和二聚體的相對濃度后，就有可能進一步評估上文單獨使用 SLS 測量的結果（圖1）。通過對光散射中固有的光強權重的理解，可以根據這些組分的相對含量來估算平均分子量。
請注意，雖然通過示差（RI，圖 2）只能識別出二聚體和單體，但 MALS 圖譜（圖3）能清晰地識別出三聚體、二聚體和單體。在此，三個峰的相對面積隨散射角度而變化，其中最大的分子在小角度下的散射最為強烈。這種量化方法用于探究不同權重的影響，并將其與圖 1 中得到的分子量進行比較。
平均分子量（MW）通過以下表達式計算得出：
單體 N=1 = 66.5 kDa
二聚體 N=2 = 2×66.5 kDa = 133 kDa
三聚體 N=3 = 3×66.5 kDa = 200 kDa
平均分子量（MW）= ( X% 單體 × 66.5 kDa ) + ( Y% 二聚體 × 133 kDa ) + ( Z% 三聚體 × 200 kDa )
表1 – 基于各組分（N=1、2 和 3）相對豐度預測的平均分子量。
| 平均分子量計算依據 | 單體分子量（kDa） | 單體 | 二聚體 | 三聚體 | 平均分子量（kDa） |
|---|---|---|---|---|---|
| MALS 130 度角下的光強加權 | 66.5 | 80.8% | 13.5% | 5.7% | 83.0 |
| MALS 105 度角下的光強加權 | 66.5 | 80.0% | 13.6% | 6.5% | 84.1 |
| MALS 90 度角下的光強加權 | 66.5 | 78.7% | 13.6% | 7.7% | 85.7 |
| RI 信號的數量加權 | 66.5 | 89.1% | 10.9% | 0.10% | 74.0 |
示差信號能夠直接反映給定材料的濃度，而散射光強則是分子量與濃度共同作用的結果。因此，僅基于光強加權的分子量會高估較大分子（特別是二聚體和三聚體）的貢獻。回想一下，單獨使用 SLS 測得的分子量約為81 kDa，這與表 1 所示基于光強加權得到的分子量結果非常接近。
總結
- 蛋白質中通常有多種具有不同聚集數的組分處于平衡狀態（以 BSA 為例，聚集數 N agg分別為1、2、3）。
- 從 Zimm 圖獲得的任何分子量都是這三種異構體的平均值。
- 當與色譜分離方法（在本案例中為 GPC）聯用時，折光指數可用于測量不同分子量組分的相對豐度。
- 使用以下兩種方法計算平均分子量相對簡單：（i）光強加權；（ii）數量加權。
結論
靜態光散射可用于測量多分散樣品（包括蛋白質）的分子量。生物樣品通常具有明確的聚集數（單體、二聚體等）。在平衡控制的自締合情況下（如蛋白質二聚化），各組分非常明確，因此分子量將是彼此的整數倍。本文探討了多組分體系中靜態光強、分子量和相對濃度之間的關系。
參考文獻
- Zimm, Bruno H., “Apparatus and Methods for Measurement and Interpretation of the Angular Variation of Light Scattering”, J. Chem. 16, 1099 (1948).
- J. C. Moore, “Gel permeation chromatography. I. A new method for molecular weight distribution of high polymers”, J. Polym. Sci., A-2, 835 (1964).
- Weiner, Bruce B., “Let There Be Light: Characterizing Physical Properties of Colloids, Nanoparticles & Proteins Using Light Scattering”, Amazon, (2019).