儀器： BI-DNDCBI-MwA
摘要
凝膠滲透色譜（GPC）與多角度靜態(tài)光散射（SLS）相結(jié)合，是一種先進(jìn)且強大的用技術(shù)，能夠無需依賴傳統(tǒng)的柱校準(zhǔn)即可得到絕對分子量值。GPC-SLS 技術(shù)通過定量評估信號強度而不是通過洗脫時間來得到分子量。此外，與聚合物標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)不同，要準(zhǔn)確解讀光散射信號，需要知道樣品的準(zhǔn)確濃度、進(jìn)樣體積及相應(yīng)質(zhì)量等信息。
引言
凝膠滲透色譜（GPC）是一種用于測定蛋白質(zhì)、聚合物和許多其他納米材料分子量的有用技術(shù)。然而，其應(yīng)用受到必須使用已知分子量（Mw）標(biāo)準(zhǔn)樣品對 GPC 柱進(jìn)行校準(zhǔn)的限制，這些標(biāo)準(zhǔn)樣品的化學(xué)性質(zhì)可能與未知樣品不同。色譜柱的分離機制基于流體動力學(xué)和尺寸排阻。在使用不同的洗脫液時，某些樣品在洗脫過程中可能會粘附在固定相上，從而導(dǎo)致分子量測量結(jié)果不準(zhǔn)確。更好的方法是給 GPC 系統(tǒng)配備多角度光散射（MALS）檢測器，從而無需柱校準(zhǔn)即可準(zhǔn)確測量分子量。先通過 GPC 對樣品進(jìn)行分離，然后由而 MALS 檢測器測量絕對分子量Mw。
布魯克海文儀器公司的分子量分析儀（BI-MwA）是一種多角度靜態(tài)光散射（MALS）檢測器，通常與BI-DNDC（示差檢測器）一起與 GPC 系統(tǒng)配套使用。通過光纖與內(nèi)部流動池耦合，可在 7 個固定角度下采集信號，從而實現(xiàn)散射光的角度依賴性測量。使用這種檢測器配置進(jìn)行的典型 GPC 實驗會生成包含多達(dá)三條曲線的色譜圖：紫外（UV）、示差（RI）和光散射（LS）。紫外檢測器通常不適合用于檢測合成聚合物，因為與蛋白質(zhì)樣品不同，合成聚合物往往只有極小的紫外吸收或無紫外吸收。光散射曲線可以展開，分別顯示每個角度的散射光強度。
基礎(chǔ)的 GPC 系統(tǒng)由單根色譜柱、進(jìn)樣器、泵和檢測器組成，高端 HPLC 系統(tǒng)則可能配備多個檢測器、自動進(jìn)樣器、色譜柱恒溫箱等更多組件。無論那種情況，GPC 色譜柱本身和檢測器都是最重要的組件。布魯克海文公司的 MwA 能夠獲取現(xiàn)有 GPC 系統(tǒng)中各類檢測器的模擬輸出，從而提供額外的檢測功能，如粘度、紫外和示差。這些數(shù)據(jù)可以讀入布魯克海文儀器公司的尺寸排阻色譜采集軟件 ParSEC 中，以生成統(tǒng)一的色譜圖。通過整合這些數(shù)據(jù)，既能計算出色譜圖中任意一點的瞬時分子量，也能算出預(yù)選范圍內(nèi)的平均分子量。
實驗設(shè)置
| 流動相： | 四氫呋喃（THF） |
| 進(jìn)樣體積： | 100 μL |
| 多角度光散射檢測器： | BI-MwA 多角度激光光散射儀 |
| 示差檢測器： | BI-DNDC 示差檢測器（波長 620 nm） |
分析
對所得數(shù)據(jù)有三種分析方式，可根據(jù)樣品的已知信息進(jìn)行選擇。對于未知樣品，可能有兩個已知參數(shù)：進(jìn)樣量和樣品的 dn/dc 值。
以下列出三種可能的情況：
| 進(jìn)樣量（進(jìn)樣濃度 × 進(jìn)樣體積） | 折光指數(shù)增量，dn/dc |
| 已知 | 已知 |
| 已知 | 未知 |
| 未知 | 已知 |
結(jié)果
我們已經(jīng)證明了準(zhǔn)確測定色譜柱中注入樣品濃度的重要性。如下表所示，即使進(jìn)樣體積存在微小差異，表觀分子量（Mw）也會發(fā)生顯著變化。
| 標(biāo)稱進(jìn)樣體積 （μL） | MW (g/mol) | Mn (g/mol) | 多分散性 (MW/Mn) | 備注 |
| 99 | 313,200 | 108,600 | 2.89 | 進(jìn)樣體積設(shè)置為比實際值低 1% |
| 100 | 316,600 | 109,700 | 2.89 | 正確進(jìn)樣體積 |
| 101 | 319,900 | 110,800 | 2.89 | 進(jìn)樣體積設(shè)置為比實際值高 1% |
使用正確進(jìn)樣體積與使用錯誤設(shè)置體積計算的對比
上表示例展示了進(jìn)樣體積變化的影響。數(shù)據(jù)由布魯克海文儀器公司的 ParSEC 軟件采集，并以三種方式進(jìn)行分析。分析在已知濃度但未知 dn/dc 值的情況下進(jìn)行。從分析結(jié)果來看，得到的分子量也變化了約 1%，這說明了進(jìn)樣體積變化的影響。
在典型操作中，ParSEC 軟件根據(jù) Zimm 方程生成 Zimm 圖，并將光散射數(shù)據(jù)外推至零角度，進(jìn)而計算出絕對濃度和分子量。由于只有單個濃度的數(shù)據(jù)，因此無法外推至零濃度。但是，與所有 GPC/SEC 軟件一樣，ParSEC 軟件允許對第二維里系數(shù)進(jìn)行校正。
結(jié)論
布魯克海文公司的 MwA 是一款功能強大的儀器，可以顯著提升現(xiàn)有 GPC 系統(tǒng)的性能。可重復(fù)的進(jìn)樣量對多角度靜態(tài)光散射（MALS）與 GPC、SEC 或其他色譜聯(lián)用技術(shù)至關(guān)重要。由于濃度是 Zimm 方程（見附錄）中的一個關(guān)鍵變量，而 Zimm 方程又是計算分子量的基礎(chǔ)，因此這一點十分必要。
- 分析方法的選擇。如果進(jìn)樣器的重復(fù)性不優(yōu)于 2%，最好選擇已知 dn/dc 值但未知進(jìn)樣量（濃度和進(jìn)樣體積）的分析方法。
- 進(jìn)樣器性能指標(biāo)。在分析 dn/dc 值未知的樣品時（這是最常見的情況），進(jìn)樣器的重復(fù)性應(yīng)優(yōu)于 1%。這一指標(biāo)很容易達(dá)到。
- 樣品濃度性能指標(biāo)。在分析 dn/dc 值未知的樣品時（這是最常見的情況），樣品濃度的準(zhǔn)確度應(yīng)優(yōu)于 1%。這一指標(biāo)也很容易達(dá)到。
附錄
光散射計算
在計算分子量時，通常使用 Zimm 方程來分析光散射數(shù)據(jù)：
Kc/ΔR = 1/Mw (1 + (q2 Rg2 )/3) + 2 A2 c
其中，K為德拜常數(shù)，是聚合物-溶劑或蛋白質(zhì)-溶劑體系的一個常數(shù)。對于垂直偏振的光，
K = 4 π2n2(dn/dc)2/(Naλ4)
其中n為溶劑折光率，Na為阿伏伽德羅常數(shù)，λ為激光波長。c 為聚合物濃度，在制備樣品溶液時精確確定，ΔR 表示溶液的散射光強與純?nèi)軇┥⑸涔鈴姷牟钪担赏ㄟ^實驗測量。